A DNS szekvenálás az az eljárás, amelynek során meghatározzák egy DNS-szakasz nukleotidjainak bázissorrendjét. Erre a célra két technikát használnak: a Maxam-Gilbert-módszert és a Sanger-féle módszert.
A módszer során egy új DNS-szálat szintetizálnak a szekvenálandó génből származó egyszálú templátot használva. A szekvenálandó DNS szálat vektorba klónozzák és hozzá illesztenek egy promert. Innen indul ki a komplementer DNS szál szintézise.
A szintézis kulcs molekulája egy didezoxi- ribonukleotid (b. ábra), mely abban különbözik a DNS-t felépítő dezoxi-robonukleotidtól (a. ábra), hogy a pentoz 3’ C- atomjáról is hiányzik az oxigén. Ez a molekula terminátorként funkcionál, hisz a beépülő dezoxi-ribonukleotidok nem tudnak a szintetizálandó szálhoz kapcsolódni, nem képes foszfodiészter- kötés kialakitására és a szintézis leáll (lánc termináció).
A didezoxi-ribonukleotid lehet ddATP, ddCTP,ddTTP,ddGTP. Ezeket kis számba adagolják négy különböző kémcsőbe, szabályos DNS prekurzorokkal és a szekvenálandó DNS szállal együtt. Mindegyik kémcsőhöz másféle didezoxi-ribonukleotidokat adnak olyan arányba a normális nukleotidokhoz képest, hogy a szintézis csak időnként szakadjon meg. Az elsőbe ddATP-t használunk, igy a szintézis az adeninoknál áll le, a másodikba ddCTP-t, ami a citozinoknál állithatja le a polimerizációt stb. A keletkező DNS fragmentumok jelölése érdekében radioaktívan jelölt dATP-t is tesznek a kémcsövekbe.
A radioaktívan jelölt fragmentumokat végül elektroforézisnak és autoradiográfiának vetik alá. Poliakrilamid géles elektroforézis során a 4 kémcsőből származó különböző hosszúságú fragmentumokat 4 párhuzamos mintahelyen szétválasztják és autoradiográfiával láthatóvá teszik. Párhuzamos csíkok formájába mutatkoznak meg a fragmentumok. Az elektroforézis segítségével képesek vagyunk 2 olyan fragmentumot is térben elkülöníteni, amelyek csak egy bázispárral hosszabbak vagy rövidebbek.
A csíkokról a bázisok leolvasása alulról felfele történik, hisz a legrövidebb fragmentum jut el legtávolabb a gélbe. Ha ez a C mintahelyen található, akkor a fragmentum C-re végződik. A következő, egy bázissal hosszabb fragmentum egy csíkkal feljebb található, és pl. a G sávba. Tehát eddig a szekvencia CG. A leolvasás így megy tovább a többi csík esetében is, míg a csíkok elkülöníthetők (3. ábra). Elsőként várhatóan az a szekvencia olvasható le, amely a vektor szervezetre jellemző és csak ezután a klónozott ismeretlen DNS szekvenciája. Néhány száz szekvenciát tudnak így leolvasni.
A Sanger-módszer nagy előnye, hogy könnyen adaptálható RNS-szekvenálásra az RNS templátról egyszálú DNS-t készítve a reverz transzskriptáz enzim felhasználásával. Ez teszi lehetővé például a riboszómális RNS szekvenálását, a molekuláris rendszerezésben történő felhasználásra.
Radioaktív izotópos jelölés helyett ma már fluoreszcens festékeket használnak. Ez gyorsabbá teszi az eljárást. A lassú leolvasást felváltja az automatizált rendszer. Mindegyik kémcsőbe más-más fluoreszcens molekulát használnak, melyek beépülnek a keletkező láncba és gerjesztés hatására különböző fényt bocsájtanak ki. A kémcsövek tartalmát összekeverve egyszerre történik az elektroforézis. A fragmentumok fluoreszcencia-spektroszkópiával kimutathatók (az áthaladó nukleotidokat egy lézer gerjeszti, a kibocsájtott fénysugár hullámhosszát felfogja egy detektor) és számítógéppel analizálhatók, így rögtön kinyomtatható a bázissorrend.
A DNS-szekvenálást ma már nagy léptékben végzik, mára számos teljes genom bázissorrendjét meghatározták.
Irodalomjegyzék
Weaver, R. F. and Hedrick, P. W. (1997): Genetika, Wm. C. Brown Publishers, pp: 436-438
Men A. E. and al. (2008): Next-Generation Genome Sequencing: Towards Personalized Medicine, British Library Cataloguing, pp: 3-5
http://www.tankonyvtar.hu/biologia/oxford-typotex-biologiai-080905-3
