6. labor

FILOGENETIKAI ANALÍZIS

I. Fejlődési törzsfa elkészítéséhez felhasználandó szekvenciák

II. A helyetesítéses modell meghatározása és faépítés

Végső törzsfa

5. labor

I. Fehérjék többszörös illesztése:

1. fehérjeszekvenciasorozatok kinyerése

2. többszörös illesztés

II. A különböző többszörös szekvencia illesztési módszerekkel kapott eredmények összehasonlítása, annak eldöntése érdekében, hogy a különbözö illesztések közül melyik a legjobb (itt)

4. labor

I. MEGABLAST-os keresés

II. BLASTP vs PSI-BLAST

III. PSI-BLAST keresés

IV. le nem írt, új gének megtalálása BLAST-tal

Labor 3.

1. BLAST program haszlálata – milyen géneket tartalmaznak a szekvenciák

2. BLAST-keresés a HIV-1 vírus gag-pol fehérjéjének (NP_057849) a szekvenciájával

3. BLAST-keresés a f atty aci d synthase [Homo sapiens] enzim (NP_004095.4) szekvenciájával

Labor 2.

1. Human beta globin és human myoglobin (NP_005359) szekvenciáinak globális és lokális összehasonlítása

2. NP_599030 cytoglobin [Homo sapiens] x-axis és CAJ44466 haemoglobin type 1 [Biomphalaria glabrata] y-axis fehérjék aminósavszekvenciáinak összehasonlítása

Feladatok

• a neanderthali ember és mai ember két mitokondriális fehérjéjének  aminosavszekvenciájának globális és lokális összehasonlítása
• rokonsági kapcsolat a víziló (hippopotamus) a disznóval (pig) vagy a bálnával (whale)

A 16 S és 23 S riboszóma RNS mutációs adatbázisa

Ez az adatbázis egy kibővített változata az előzőnek. Ingyenesen szolgáltat egyedi adatokat az RNS szerkezet összehasonlító és strukturális analíziséről. Rákereshetünk egy specifikus organizmusra, egy specifikus nukleotid helyére, fenotípusokra. Találhatunk ezzel kapcsolatos cikkeket is.

Az adatbázis elérhetősége:  http://ribosome.fandm.edu

Az adatbázis tartalmaz 1024 találatot, melyből 485 16S rRNS Escherichia coli-tól származik, 37 szintén 16S RNS más szervezetektől, 421 23S rRNS E. coli-tól és 81 23S RNS más organizmusoktól.

Itt megtalálhatók a legújabb, legfrissebb információk is a 16 S és 23 S riboszóma RNS mutációkról. Továbbá információkat szolgáltat a ribiszómák mutációs helyeiről és arról, hogy milyen változás történt. Mivel az E. coli –ról van a legtöbb adat, az organizmusokban fellelhető változásokat össze hasonlítják az E.coli RNS szerkezetével. Így információkat szerezhetünk minden egyes mutációról. Fenotípus alapján azonosítják a mutációkat.

Sanger féle DNS szekvenálási módszer

A DNS szekvenálás az az eljárás, amelynek során meghatározzák egy DNS-szakasz nukleotidjainak bázissorrendjét. Erre a célra két technikát használnak: a Maxam-Gilbert-módszert és a Sanger-féle módszert.

A módszer során egy új DNS-szálat szintetizálnak a szekvenálandó génből származó egyszálú templátot használva. A szekvenálandó DNS szálat vektorba klónozzák és hozzá illesztenek egy promert. Innen indul ki a komplementer DNS szál szintézise.

A szintézis kulcs molekulája egy didezoxi- ribonukleotid (b. ábra), mely abban különbözik a DNS-t felépítő dezoxi-robonukleotidtól (a. ábra), hogy a pentoz 3’ C- atomjáról is hiányzik az oxigén. Ez a molekula terminátorként funkcionál, hisz a beépülő dezoxi-ribonukleotidok nem tudnak a szintetizálandó szálhoz kapcsolódni, nem képes foszfodiészter- kötés kialakitására és a szintézis leáll (lánc termináció).

A didezoxi-ribonukleotid lehet ddATP, ddCTP,ddTTP,ddGTP. Ezeket kis számba adagolják négy különböző kémcsőbe, szabályos DNS prekurzorokkal és a szekvenálandó DNS szállal együtt. Mindegyik kémcsőhöz másféle didezoxi-ribonukleotidokat adnak olyan arányba a normális nukleotidokhoz képest, hogy a szintézis csak időnként szakadjon meg. Az elsőbe ddATP-t használunk, igy a szintézis az adeninoknál áll le, a másodikba ddCTP-t, ami a citozinoknál állithatja le a polimerizációt stb. A keletkező DNS fragmentumok jelölése érdekében radioaktívan jelölt dATP-t is tesznek a kémcsövekbe.
A radioaktívan jelölt fragmentumokat végül elektroforézisnak és autoradiográfiának vetik alá. Poliakrilamid géles elektroforézis során a 4 kémcsőből származó különböző hosszúságú fragmentumokat 4 párhuzamos mintahelyen szétválasztják és autoradiográfiával láthatóvá teszik. Párhuzamos csíkok formájába mutatkoznak meg a fragmentumok. Az elektroforézis segítségével képesek vagyunk 2 olyan fragmentumot is térben elkülöníteni, amelyek csak egy bázispárral hosszabbak vagy rövidebbek.
A csíkokról a bázisok leolvasása alulról felfele történik, hisz a legrövidebb fragmentum jut el legtávolabb a gélbe. Ha ez a C mintahelyen található, akkor a fragmentum C-re végződik. A következő, egy bázissal hosszabb fragmentum egy csíkkal feljebb található, és pl. a G sávba. Tehát eddig a szekvencia CG. A leolvasás így megy tovább a többi csík esetében is, míg a csíkok elkülöníthetők (3. ábra). Elsőként várhatóan az a szekvencia olvasható le, amely a vektor szervezetre jellemző és csak ezután a klónozott ismeretlen DNS szekvenciája. Néhány száz szekvenciát tudnak így leolvasni.
A Sanger-módszer nagy előnye, hogy könnyen adaptálható RNS-szekvenálásra az RNS templátról egyszálú DNS-t készítve a reverz transzskriptáz enzim felhasználásával. Ez teszi lehetővé például a riboszómális RNS szekvenálását, a molekuláris rendszerezésben történő felhasználásra.
Radioaktív izotópos jelölés helyett ma már fluoreszcens festékeket használnak. Ez gyorsabbá teszi az eljárást. A lassú leolvasást felváltja az automatizált rendszer. Mindegyik kémcsőbe más-más fluoreszcens molekulát használnak, melyek beépülnek a keletkező láncba és gerjesztés hatására különböző fényt bocsájtanak ki. A kémcsövek tartalmát összekeverve egyszerre történik az elektroforézis. A fragmentumok fluoreszcencia-spektroszkópiával kimutathatók (az áthaladó nukleotidokat egy lézer gerjeszti, a kibocsájtott fénysugár hullámhosszát felfogja egy detektor) és számítógéppel analizálhatók, így rögtön kinyomtatható a bázissorrend.
A DNS-szekvenálást ma már nagy léptékben végzik, mára számos teljes genom bázissorrendjét meghatározták.

Irodalomjegyzék

Weaver, R. F. and Hedrick, P. W. (1997): Genetika, Wm. C. Brown Publishers, pp: 436-438
Men A. E. and al. (2008): Next-Generation Genome Sequencing: Towards Personalized Medicine, British Library Cataloguing, pp: 3-5

http://www.tankonyvtar.hu/biologia/oxford-typotex-biologiai-080905-3